大鼠雌二醇（E2）定量检测试剂盒（ELISA）是一种用于定量检测血清、血浆、细胞培养上清液、组织中大鼠雌二醇（E2）含量的科研工具。在使用该试剂盒前，务必仔细阅读本说明书，且其仅供科研使用，不得用于临床诊断。

　　本试剂盒采用竞争 ELISA 法。首先往预先包被雌二醇（E2）抗体的微孔板中依次加入样本 / 校准品和 Asaay Diluent，经过温育洗涤后，加入 SA - HRP 再次温育，随后洗涤并加入底物 TMB 显色，室温显色后用终止液终止反应，最后读取 OD 值。OD 值高低和样品中的雌二醇（E2）呈负相关，即 OD 值越低，样品中雌二醇（E2）含量越高。该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、重复性好、操作简单快速等优点，对血清中雌二醇（E2）的变化具有可靠的检出性能。

　　必须在试剂盒标示的有效期内使用，过期产品不得使用，以确保检测结果的准确性和可靠性。

　　如需稀释样品，可用 PBS（PH7.4）进行稀释，以保证实验条件的一致性。

　　当样本值高于最高标准品浓度值时，应将样本适当稀释后重新测定，确保样本浓度在试剂盒的有效检测范围内。

　　待测样本中可能存在的异嗜抗体会干扰检测结果，在检测前需采取措施排除该因素，以减少误差。

　　通过其他方法得到的检测结果，与本试剂盒测定结果不具有直接可比性，因此在实验数据对比和分析时，应注意采用相同的检测方法和试剂盒。

　　加校准品与样本时，每个校准品浓度和样本都要更换移液枪头，公共组分应悬臂加样，避免交叉污染，保证实验的准确性和可靠性。

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　　合适的温育时间和充分的洗涤步骤是保证实验结果准确性的必要条件，应严格按照说明书要求进行操作。

　　使用自动洗板机时，加入一个 30 秒浸泡的步骤，可提高检测精度，减少误差。

　　底物溶液应为无色液体，若保存过程中变为蓝色，则代表底物溶液已经失效，不得使用，否则会导致实验结果错误。

　　终止液加样顺序应与底物溶液加样顺序一致，加入终止液后，蓝色底物产物会瞬间变为黄色，便于准确读取 OD 值。

　　实验中，用剩的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存，防止板条受潮或污染，影响后续使用。

　　所有液体组分在使用前应充分摇匀，并严格按照说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行温育操作，确保实验条件的一致性和稳定性。

　　未开封的试剂盒应保存在 2 - 8 度，不得使用过期试剂盒，以保证试剂的活性和稳定性。试剂盒的组成包括：

　　：0.5ml / 管 * 6 管，由抗原配制的 6 个浓度标准品，浓度依次为 64、32、16、8、4、0pmol/L，用于绘制标准曲线，确定样品中雌二醇（E2）的含量。

　　：有 96T/48T 两种规格，预包被固相抗体，为抗原抗体反应提供场所。

　　：30mL，含 0.15% Tween20 的 PBS，用于洗涤微孔板，去除未结合的物质，减少非特异性结合。

　　本品必须按照具有潜在的感染性进行处理，处理过程应当遵循通用的安全措施，确保实验人员的安全和实验室环境的安全。

　　检测必须符合实验室管理规范的规定，严格防止交叉污染，所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按照传染物进行处置，避免对实验室环境和人员造成危害。

　　试剂盒的液体组分中，含有 proclin - 300 防腐剂，可能引起皮肤过敏反应，在实验过程中应避免吸入烟雾与皮肤接触，实验人员应佩戴好防护用品，如手套、口罩等。

　　底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激作用，同样要避免吸入烟雾，确保实验人员的身体健康。

　　实验人员应戴上防护手套，实验完成后彻底洗手，减少试剂残留对身体的潜在危害。

　　：在 4000rpm 条件下离心 20min，去除细胞颗粒和聚合物，上清液保存在 20℃以下，避免反复冻融，以防止蛋白质降解等因素影响检测结果。

　　：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，4000rpm 条件下离心 20min，小心地分离出血清，保存在 - 20℃以下，避免反复冻融，确保血清中雌二醇（E2）的稳定性。

　　：可使用肝素，EDTA，或柠檬酸钠作为抗凝剂，在 4000rpm 条件下，离心 20 分钟取上清，血浆保存在 - 20℃以下，避免反复冻融，以保证血浆样本的质量。

　　：用预冷的 PBS (0.01 M,pH = 7.4) 冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎，将剪碎的组织与对应体积的 PBS（一般按 1: 9 的重量体积比，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录，推荐在 PBS 中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨，为了进一步裂解组织细胞，还可以对匀浆液进行超声破碎或反复冻融，最后将匀浆液 5000×g 离心 5 - 10 分钟，取上清检测，以确保组织中的雌二醇（E2）能够充分提取并检测。

　　样本在 2 - 8℃条件下，可以储存 72h，或者在 - 20℃储存 6 个月。样本收集后，若不是一次检测完，应按一次用量分装冻存，避免反复冻融，使用时在室温下解冻，确保样品均匀充分解冻，以保证样本中雌二醇（E2）的含量不受影响，从而确保检测结果的准确性。

　　将各种试剂移至室温平衡两小时，取浓缩洗涤液，根据当批检测数量，用蒸馏水 1：20 稀释，混匀后备用，以保证试剂在适宜的温度和浓度下进行反应。

　　将预包被板从密封袋中取出，设一个空白对照孔，不加任何液体；每个校准品设 2 孔，每孔加入对应校准品 15μl；其余每个检测孔直接加待测血清或质控品 15μl，确保加样的准确性和一致性。

　　除空白孔外所有孔加入 Asaay Diluent 100μl，混匀，贴上封板膜，置 37℃温育 60 分钟，使抗原抗体充分结合，保证反应的充分性。

　　手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置 10 秒甩干，重复 3 次后拍干；洗板机洗板：选择洗涤 3 次程序洗板后拍干，通过充分洗涤去除未结合的物质，减少非特异性结合。

　　每孔加入 SA - HRP 100μl（空白对照孔除外），混匀，贴上封板膜，置 37℃温育 30 分钟，使酶标抗体与抗原抗体复合物结合，为显色反应做准备。

　　手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置 10 秒甩干，重复 3 次后拍干；洗板机洗板：选择洗涤 3 次程序洗板后拍干，确保未结合的酶标抗体被完全去除。

　　每孔加 TMB 100μl，振荡混匀后，置 37℃避光显色 15 分钟，每孔加终止液 100μl，用酶标仪读数，取波长 450nm，先用空白对照孔调零点，然后测定各孔光密度值（OD 值），通过 OD 值的测定，结合标准曲线，计算样品中雌二醇（E2）的浓度。

　　检测完成后，以标准品浓度做为纵坐标，对应的吸光度（OD 值）作为横坐标，利用计算机软件，采用四参数 Logistic 曲线 - pl），创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD 值），利用方程计算样品的浓度值。如果样品被稀释，通过上述方法测的的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的最终浓度，从而准确得到样品中大鼠雌二醇（E2）的含量。

　　：液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；所有组分应无包装破损，各组分装量不少于组分表中要求，确保试剂盒的完整性和可用性。

　　：用四参数 Logistic 曲线 - pl），剂量 - 反应曲线相关系数（r）的绝对值应不低于 0.9900，保证标准曲线的准确性和可靠性，从而提高检测结果的准确性。

　　：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在同一个板块内精度评估，批内变异系数 CV% 小于 15%，表明在同一实验板内检测结果的稳定性和重复性良好。

　　：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在不同板块内精度评估，批间变异系数 CV% 小于 15%，说明不同实验板间检测结果具有可比性和可靠性。

　　：最低检出限应不高于 0.1pmol/L，能够检测到低浓度的雌二醇（E2），为科研实验提供更精确的数据支持。

　　：三组已知的高、中、低浓度样品，进行五次在同一个板块内回收率评估，回收率在 85% - 115% 之间，表明本试剂盒的检测准确性较高，能够有效地检测出样品中的雌二醇（E2）。

　　：2℃ - 8℃保存，有效期 6 个月，在规定的保存条件和有效期内，试剂盒的性能稳定，可保证实验结果的可靠性。

　　：4 pmol/L – 64 pmol/L，能够覆盖大多数实验样本中雌二醇（E2）的浓度范围，满足不同实验条件下的检测需求。

　　在使用大鼠雌二醇（E2）定量检测试剂盒（ELISA）时，应严格按照说明书的要求进行操作，注意实验过程中的各个环节，以确保实验结果的准确性和可靠性，为科研工作提供有力的支持。